HPLC中三元泵與二元泵的比例換算與三元泵的優(yōu)勢(shì)

Part 1 比例換算原理及示例

在HPLC中，三元泵（也稱(chēng)三通道）與 二元泵（也稱(chēng)雙通道）的比例換算是方法轉(zhuǎn)移或儀器適配的常見(jiàn)操作。以下簡(jiǎn)述換算邏輯、步驟及注意事項(xiàng)：

核心原則

1. 三元泵梯度：可獨(dú)立控制A/B/C三通道比例（如A:水相、B:有機(jī)相、C:酸或緩沖鹽溶液）。 

2. 二元泵限制：僅能控制A/B兩通道比例，需將三元中的一種溶劑預(yù)混合到A或B通道中。

換算步驟（以預(yù)混法為例）

目標(biāo)：將三元泵方法（如A/B/C通道）轉(zhuǎn)移到二元泵（如A/B通道）上運(yùn)行。

1. 識(shí)別恒定比例溶劑 

 分析三元梯度表，找到“比例不變”或“與另一通道同步變化”的溶劑（以下以C通道為例）。  前提：C溶劑與A或B的相對(duì)比例在梯度中不能獨(dú)立變化（否則無(wú)法精確轉(zhuǎn)換）。

1. 預(yù)混合溶劑 

     示例1：C通道保持不變。 如以下三元梯度：  

觀察到C通道的比例不變，則可合并，二元梯度如下：

示例2：B通道與C通道比例同步變化

如以下三元梯度：  

該情況下B通道與C通道可視作“一瓶”，預(yù)混合各占50%即可，二元梯度如下：                 

示例3：B通道與C通道比例不同步變化，則可通過(guò)起點(diǎn)與終點(diǎn)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為二元，如：

可以觀察到該梯度明顯不適用于示例1與示例2的方法，此時(shí)可以采用以下方法：

A瓶：水-乙腈-1%甲酸水溶液=80-10-10

B瓶：水-乙腈-甲酸水溶液=50-30-20

可得二元泵梯度為

示例4：存在分段梯度，則無(wú)法轉(zhuǎn)換為二元：

Part 2 三元泵相比二元泵的優(yōu)勢(shì)

1. 便于對(duì)比不同種類(lèi)或pH的流動(dòng)相

在開(kāi)發(fā)一個(gè)新的分析方法時(shí)，通常需要篩選不同的溶劑組合以找到最佳分離效果。例如，可能需要嘗試：

不同pH的緩沖液：比如甲酸銨緩沖液（pH3.5）和乙酸銨緩沖液（pH 5.0）。

不同的有機(jī)相：比如甲醇和乙腈，它們的洗脫強(qiáng)度和選擇性不同。

對(duì)于二元泵，如果你想從“乙腈-甲酸銨緩沖液（pH3.5）”切換到“乙腈-乙酸銨緩沖液（pH 5.0）”，你必須手動(dòng)更換泵B的溶劑瓶，并從泵A的瓶子中倒掉舊的緩沖液，更換新的緩沖液。這需要停機(jī)、沖洗系統(tǒng)、重新平衡，非常耗時(shí)且容易出錯(cuò)（如產(chǎn)生氣泡、殘留污染）。

對(duì)于三元泵，你可以將三種溶劑預(yù)先準(zhǔn)備好：例如，A通道為甲酸銨緩沖液（pH3.5），B通道為乙酸銨緩沖液（pH 5.0），C通道為乙腈。只需在軟件方法中輕松改變梯度程序，即可實(shí)現(xiàn)從“A/C”混合到“A/C”混合的無(wú)縫切換。無(wú)需手動(dòng)更換溶劑瓶，大大提升了方法篩選和優(yōu)化的效率。

2. 輕松實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的多元梯度

某些復(fù)雜的分離任務(wù)需要三種或更多種溶劑以特定比例參與梯度洗脫。

pH梯度與有機(jī)相梯度結(jié)合：例如，在分離離子化合物或生物大分子（如多肽、蛋白質(zhì)）時(shí)，可能需要同時(shí)改變有機(jī)相比例和緩沖液的pH值。三元泵可以設(shè)置一個(gè)通道為酸性緩沖液，一個(gè)為堿性緩沖液，第三個(gè)為有機(jī)相，從而實(shí)現(xiàn)非常精細(xì)的分離控制。離子對(duì)色譜：需要在運(yùn)行時(shí)動(dòng)態(tài)加入離子對(duì)試劑。可以設(shè)置一個(gè)通道為含水離子對(duì)試劑的流動(dòng)相，另外兩個(gè)為有機(jī)相和水，方便控制離子對(duì)試劑的濃度。

對(duì)于二元泵，實(shí)現(xiàn)這類(lèi)三元梯度幾乎不可能，或者需要預(yù)先離線混合好緩沖液，靈活性極差。

3. 方便地調(diào)節(jié)鹽濃度，使方法開(kāi)發(fā)事半功倍

方法開(kāi)發(fā)中，通常需要嘗試不同的鹽濃度改善分離效果，這一點(diǎn)對(duì)于Comix混合作用柱尤為重要。

如以下案例中，通過(guò)改變高濃度鹽溶液所占的比例，輕松實(shí)現(xiàn)了出峰順序的倒轉(zhuǎn)，可滿(mǎn)足不同需求

這也是comix方法開(kāi)發(fā)中常用的手段，即配一瓶高濃度鹽溶液（如200mM)，通過(guò)改變?cè)撓嘣诒弥械谋壤瑏?lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)“體系中鹽濃度”的控制。

如以下梯度：                   

同時(shí)，參考案例與文獻(xiàn)時(shí)，也要避免“談鹽色變”，使用的高濃度鹽溶液僅僅是三元泵的其中之一，進(jìn)入色譜柱的流動(dòng)相是經(jīng)過(guò)充分混合的。體系濃度15mM或20mM鹽溶液完全可兼容質(zhì)譜。